PCR實驗室設計之分區及其配置
PCR實驗室在臨床上又稱基因擴增實驗室。理想的的標準PCR設計組合式實驗室包括4個分區,分別是:試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區、擴增產物分析區,分區及其儀器設備配置參見下圖。
普通的 PCR 儀對標本擴增后,需再經電泳或雜交實驗分析,才能判斷標本含有哪種細菌、病毒。
如果使用全自動分析儀如實時熒光定量PCR儀,由于擴增與分析集成在一臺儀器內進行,故擴增區與分析區合并為一, PCR 實驗室只需設置3個房間。PCR 兩種分區及其配置置參見下圖 。
PCR實驗室各區主要功能及相關要求描述:
試劑儲存和準備區(I區);儲存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備,可配置電泳溶液。試劑配置在潔凈臺內操作,一般采用 900mm 的垂直單向流潔凈臺。冰箱一般為4℃冷藏柜。
標本制備區(Ⅱ區):主要是核酸(RNA、DNA)的提取和純化,包括臨床標本的保存、核酸儲存、核酸加人到擴增反應管、cDNA的合成。核酸提取時需使用苯酚、氯仿等有毒致癌物,高速離心后得到沉淀的 DNA。PCR反應的*大特點是具有較大的擴增能力與極高的靈敏性,但也正是這種特點,使得極其微量的污染即可造成假陽性的檢測結果,因此核酸的純化操作應生物安全柜內進行,為避免提取核酸氣溶膠在柜內反復循環,造成標本間交叉污染,出現假陽性結果,*好采用全外排的ⅡB2生物安全柜。標本及 DNA需在一20℃或-80℃的低溫冰箱中保存。處理大分子 DNA時使用超聲波水浴儀(水浴鍋)。房間相對于鄰近區域為正壓,以避免從鄰近區進入的氣溶膠污染。
擴增反應混合物配制和擴增區(Ⅲ區):主要進行的操作為 DNA 或 cDNA 擴增。巢式PCR 測定中,通常在第一輪擴增后必須打開反應管,因此巢式擴增有較高的污染危險性,第二次加樣必須在本區潔凈臺內進行。房間相對于產物分析區應為正壓,相對于標本制備區為負壓。
擴增產物分析區(Ⅳ區):對擴增后的產物種類進行分析,判斷是哪種細菌、病毒。對于普通的PCR 儀,目前*常用的方法是電泳分析。為防止分析產物污染其他區域,房間應為負壓。設備中電熱板額定功率1~4kw,發熱量較大。
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